熒光原位雜交的染色體分析

（一）標(biāo)本的制備

1． 室溫下，依次用 70 ％、 90 ％和 100 ％的乙醇脫水 5min 。

2． 空氣干燥載玻片。ELISA試劑盒

3． 若短期使用，載玻片可在室溫貯存數(shù)天。若載玻片要保存，應(yīng)在室溫下過夜使組織“老化”（ aged ），然后放入容器中，該容器密封于含干燥劑的塑料袋內(nèi)，－ 70 ℃保存。根據(jù)作者的經(jīng)驗， 6 個月內(nèi)使用的載玻片可貯存在－ 20 ℃。在雜交實驗之前解凍這些載玻片，不提倡反復(fù)凍融載玻片。

（二）缺口平移法標(biāo)記探針

通過缺口平移法（酰）化 DNA 探針

1． 結(jié)合： 2 μ g 探針 DNA ， 10 μ l 10 ×反應(yīng)緩沖液， 10 μ l β－巰基乙醇， 10 μ l 核苷酸母液（ 0.5mmol/L dATP, 0.5mmol/L dCTP, 0.5mmol/L dGTP, 0.5mmol/L -16-dUTP 和 0.12mmol/L dTTP ）， 20 單位 DNA 聚合酶 I 和 1 ： 1000 稀釋的 DNase I ，加雙蒸水至 100 μ l （zui后加酶）。

2． 在 15 ℃溫育 2h 。

3． 置反應(yīng)混合物于冰浴直至反應(yīng)產(chǎn)物的大小被確定。

4． 凝膠電泳檢測探針分子的長度：取 10 μ l 反應(yīng)混合物，加入凝膠上樣緩沖液，水浴箱中煮沸 2 3 分鐘使其變性，冰浴 3min ，上樣到 1 ～ 2 ％的瓊脂糖微型凝膠中，并以適當(dāng)大小的標(biāo)準(zhǔn)品做對照，以 50V/cm 電泳 3min 。用濃度為 0.5 μ g/ml 的溴化乙錠染膠，在紫外透照儀上顯示 DNA 并拍照。

5． 對于的雜交條件，探針（可見一脫尾）應(yīng)為 100 ～ 500nt 。根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行下述步驟：

a. 如果探針大小在期望的范圍內(nèi)，進(jìn)行步驟 6 。

b.如果探針太大，可加入更多的 DNase I ，在 15 ℃溫育。

c.如果探針未*消化，純化探針并重復(fù)缺口平移法。

d. 如果探針太短，用較少的 DNase 重復(fù)反應(yīng)。

6． 為使 DNase 失活，加入 2 μ l 0.5mol/L EDTA 和 1 μ l SDS ，在 68 ℃加熱 10min 。

7． 用離心柱凝膠過濾法從標(biāo)記的探針中分離出未摻入的核苷酸：

a. 用 1ml 注射器裝入硅膠玻璃棉至 0.2ml 刻度處，加經(jīng)緩沖液平衡的 Sephadex G50 至 1ml 刻度處，將此柱置 15ml 的離心管內(nèi)，室溫下， 3000r/min 離心 6min 。

b. 去除過柱后的液體，加入緩沖液重復(fù)離心直至柱內(nèi)容物緊密充填至 1ml 刻度處，加 100 μ l 柱緩沖液， 3000r/min 離心 6min ，重復(fù)洗滌步驟 3 次。在zui后一步洗滌后，確保流量與上樣緩沖液量相等，即 100 μ l 。

c. 探針溶液離心之前，放 1.5ml 的反應(yīng)管在注射器下方的 15ml 管內(nèi)，與前面步驟相同，加探針液到柱內(nèi)并離心，過柱后的液體收集在反應(yīng)管中，這時已含有 20ng/ μ l 的標(biāo)記探針。該探針已可用于原位雜交或貯存于－ 20 ℃。

用缺口平移法進(jìn)行標(biāo)記

與缺口平移地化法幾乎相同，僅 10 ×寡核苷酸母液成分不同：

0.5mmol/L dATP, 0.5mmol/L dCTP, 0.5 mmol/L dGTP, 0.125 mmol/L  -11-dUTP ， 0.375mmol/L dTTP 。

（三）斑點(diǎn)印跡分析法檢測標(biāo)記物

1． 將分裝的 1 μ l 標(biāo)準(zhǔn) DNA 稀釋液和同法配制的 1 μ l 待測 DNA 稀釋液點(diǎn)于硝酸纖維素膜上。

2． 硝酸纖維素膜置 80 ℃真空烤箱內(nèi) 1h 。

3． 室溫下，用 AP7.5 緩沖液漂洗硝酸纖維素膜 1min 。

4． 將硝酸纖維素膜密封于含 10ml 封閉液的塑料袋中，置 37 ℃溫育 30min 。

5． 打開塑料袋的一端，棄去封閉液，加入新鮮配制的鏈親和素 - 堿性磷酸酶交  聯(lián)物溶液，重封塑料袋口，置 37 ℃溫育 30min 。6． 從塑料袋中取出硝酸纖維膜，用 AP7.5 緩沖液漂洗（室溫下兩次各 5min ），再用 AP9.5 緩沖液漂洗（室溫下 10min ）。

7． 將硝酸纖維素膜重封于含顯影液的塑料袋中（ 33 μ l NBT 溶于 10ml AP9.5 緩沖液中）。小心混勻后（不可漩渦混勻?。┘尤?25 μ l BCIP ，再次輕輕混勻反應(yīng)液，在 37 ℃溫育直至顯影達(dá)滿意程度，一般 15 ～ 60min 。

8． 從塑料袋中移去硝酸纖維膜，用 TE 緩沖液終止顯色反應(yīng)。

9． 空氣干燥后，評估分析結(jié)果：測試組和對照組 DNA 的顏色密度應(yīng)進(jìn)行比較。在理想的雜交結(jié)果，zui低稀釋度信號應(yīng)當(dāng)是可見的。

（四）熒光標(biāo)記原位雜交探針的混合與變性

1． 混合 20 ～ 60ng 單拷貝 DNA 和 3 ～ 5 μ g 經(jīng)剪切的鮭精 DNA （作為載體）。如果反應(yīng)后體積少于 10 μ l ，可凍干；若體積較大，可加入 1/20 體積的 3mol/L 乙酸鈉和 2 倍體積 100% 乙醇使 DNA 沉淀?；靹虿⒅茫?70 ℃ 30min 。在 4 ℃用 Eppendorf 離心機(jī)以 12 000r/min 離心 10min ，棄上清，沉淀物以 500 μ l 70 ％乙醇漂洗后再離心（ 4 ℃， 12 000r/min, 10min ），棄上清并凍干。

2． 重懸于 5 μ l 去離子的甲酰胺中，于室溫漩渦混勻數(shù)分鐘。

3． 加 5 μ l 雜交緩沖液，漩渦混勻 5 ～ 10min 。

4． 在 75 ℃使 DNA 探針變性 5min ，接著冰浴 5min ，這時探針已可用于雜交。

（五）載玻片上 DNA 變性

變性

1． 在載玻片上選擇合適的雜交區(qū)，用鉛石筆在載玻片的另一面作記號。ELISA試劑盒

2． 變性前將載玻片置 60 ℃烤箱孵育以防止變性液加至載玻片時溫度的降低。

3． 加變性液至 Coplin 廣口瓶內(nèi)，在水浴箱中加熱至 70 ℃，用置于瓶內(nèi)的溫度計檢測變性液的溫度（這是關(guān)鍵步驟！）為得到好的結(jié)果，溫度應(yīng)達(dá) 70 ℃。

4． 將預(yù)熱的載玻片（一次不多于 3 片）移至含變性液的 Coplin 廣口瓶內(nèi)準(zhǔn) 2min 。

5． 立即將載玻片依次移入含 70 ％、 90 ％和 100 ％乙醇（冰冷）的 Coplin 廣口瓶內(nèi)，各 5min 。

6． 空氣干燥后，載玻片已可用于雜交。

雜交

1． 將 10 μ l 含變性探針的雜交混合物加至載玻片的變性靶 DNA 上。

2． 在雜交的液滴上小心地蓋上 18 × 18cm 的蓋玻片，不要滯留氣泡。

3． 用橡皮泥將蓋玻片四周封好，置載玻片于濕盒內(nèi)， 37 ℃溫育過夜。

（六）檢測

1． 分別在 42 ℃和 60 ℃的水浴箱內(nèi)預(yù)熱漂洗液 A （ 50 ％甲酰胺， 2 × SSC pH7.0 ）和 B （ 1 × SSC ～ 0.1 × SSC pH7.0 ）。

2． 從濕盒內(nèi)取出載玻片，用鑷子小心除去橡皮泥。

3． 置載玻片于含預(yù)熱至 42 ℃漂洗液 A 的 Coplin 廣口瓶中，在水浴箱中振蕩 10min 直至蓋玻片脫落，將載玻片移至另一含漂洗液 A 的廣口瓶中，振蕩 5min ，更換漂洗液 A 兩次，每次振蕩 5min 。

4． 將載玻片移入含預(yù)熱（ 60 ℃）漂洗液 B 的 Coplin 廣口瓶中，漂洗 5min ，更換漂洗液兩次，每次漂洗 5min 。

5． 將載玻片從 Coplin 廣口瓶中取出，棄盡液體，加 200 μ l 封閉液，蓋以 22 × 40mm 的蓋玻片，置濕盒內(nèi)， 37 ℃溫育至少 30min 。

6． 從每張載玻片上移去蓋玻片，去除過的的液體，加 200 μ l 帶熒光的報道分子檢測液（如 5 μ g/ml 與熒光素偶聯(lián)的親和素或 6 μ g/ml 與羅丹明偶聯(lián)的抗抗體），在 37 ℃濕盒內(nèi)溫育 30min 。所有的后序步驟均應(yīng)在避光的 Coplin 廣口瓶中進(jìn)行（如外裹錫箔紙）。

7． 移去蓋玻片，將載玻片移至漂洗液 C （ 4 × SSC ， 0.1 ％ Tween20 pH7.0 ）中，在 42 ℃（振蕩水浴箱）漂洗三次各 5min 。

8． 將載玻片置入含復(fù)染劑（如 2 × SSC ， 200ng/ml DAPI ）的 Coplin 廣口瓶中，室溫振蕩 20min 。

9． 將載玻片移至漂洗液 D （ 2 × SSC ， 0.05 ％ Tween 20 ）的 Coplin 廣口瓶中，室溫中溫育 1 ～ 2min 。

10． 從 Coplin 廣口瓶中取出載玻片，加 20 ～ 30 μ l 防退色液并蓋以 22 × 40mm 的蓋玻片，置載玻片于合適的盒內(nèi)，以便 4 ℃保存。

（七）染色體原位抑制（ CISS ）雜交

1． 結(jié)合適量標(biāo)記的探針 DNA ，人競爭 DNA （ Cot1 片段） 2 ～ 4 μ g ，加鮭精 DNA 至總量為 10 μ g DNA 。

2． 加 1/20 體積乙酸鈉（ pH5.2 ）和 2 倍體積的乙醇使 DNA 沉淀，置－ 70 ℃ 30min 。 12 000r/min 離心 10 分鐘后，大多數(shù)可見沉淀。棄上清并用 70 ％乙醇漂洗，再離心棄上清。

3． 凍干樣本，重溶于 5 μ l 去離子甲酰胺中。

4． 加 5 μ l 變性緩沖液。

5． 在 75 ℃溫育 5min 使 DNA 變性。

6． 迅速將含探針溶液的微量離心管移至 37 ℃，溫育 5 ～ 20min （甚至更長）使部分 DNA 再退火。

7． 預(yù)退火的探針與變性 DNA 在載玻片上混勻。

8． 繼續(xù)進(jìn)行（四，五，六）所述的步驟。

（八）信號放大

1． 小心地從載玻片上移去蓋玻片。

2． 將載玻片移至漂洗液 C （ 4 × SSC ， 0.1 ％ Tween20 pH7.0 ）中，在 42 ℃漂洗三次共 10min 。

3． 從 Coplin 廣口瓶中取出載玻片，吸去載玻片上的殘液，加 200 μ l 含 1 ～ 5 μ g/ml 化的抗親和素抗體的檢測緩沖液，覆以 22 × 40mm 的蓋玻片，置濕盒內(nèi)在 37 ℃溫育 30min 。

4． 在 42 ℃含漂洗液 C 的 Coplin 廣口瓶中漂洗載玻片三次各 5min 。

5． 從 Coplin 廣口瓶中取出載玻片，吸去載玻片上的殘液，加 200 μ l 含 5 μ g/ml 偶聯(lián)熒光染料的親和素檢測緩沖液。

6． 漂洗和染色體步驟見（六）。

（九）多色熒光標(biāo)記原位雜交

1． 在 DNA 沉淀之前，采用幾種與不同報道分子結(jié)合的探針，而不是僅用一種探針。

2． 合適的報道分子結(jié)合物必須加到檢測緩沖液中（六）。每種報道分子結(jié)合物應(yīng)與一種熒光染料結(jié)合，該染料在光譜上能與同一實驗所用的其它熒光染料相區(qū)別。ELISA試劑盒