豬胸膜肺炎放線桿菌PCR試劑盒產(chǎn)生各種條帶的常見原因

1.產(chǎn)生非特異性條帶

1)用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

2)在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。

3)由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。

2. 產(chǎn)生彌散（smear）條帶

1)在PCR反應(yīng)體系中di一鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高

2)減少引物的用量

3)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)

4)在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。

3. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶

1)大多數(shù)情況下是由于退火溫度過(guò)低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的

2)對(duì)于長(zhǎng)片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）