ELISA實(shí)驗(yàn)中操作常見問題

如何正確使用酶結(jié)合物？
1.酶結(jié)合物的稀釋液在稀釋液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%BSA或5%脫脂奶粉），通過競(jìng)爭(zhēng)抑制酶結(jié)合物在固相載體上的非特異性吸附。一般還加入能夠抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20（0.05%的濃度較為適宜）。
2.正確稀釋酶結(jié)合物酶結(jié)合物的合適工作濃度需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定，濃度過高易導(dǎo)致本底偏高，濃度過低則會(huì)導(dǎo)致陽性信號(hào)的減弱。酶結(jié)合物在使用前稀釋，稀釋后的酶結(jié)合物不宜保存，因?yàn)榈蜐舛鹊拿附Y(jié)合物極易失活。

如何選擇合適的陽性對(duì)照？
陽性對(duì)照的基本組成應(yīng)該盡量與檢測(cè)樣本的組成一致，一般陽性對(duì)照多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，加入一定量的待檢物質(zhì)。比如，以人血清為標(biāo)本的測(cè)定，陽性對(duì)照多用確定的病人血清或者以復(fù)鈣人血漿為原料加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品。如何選擇合適的陰性對(duì)照？陰性對(duì)照的基本組成也應(yīng)該盡量與檢測(cè)樣本的組成一致，先行檢測(cè)確定其中不含待檢物質(zhì)。比如，檢測(cè)人血清標(biāo)本時(shí)，陰性對(duì)照應(yīng)該選擇正常人血清；檢測(cè)免疫動(dòng)物血清中抗體效價(jià)時(shí)，陰性對(duì)照應(yīng)該選擇該動(dòng)物的免疫前血清。
如何選擇*化的包被條件？
1.包被抗原的選擇
包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類。天然蛋白需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被，對(duì)于含雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被（先用能夠與目的抗原反應(yīng)的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標(biāo)板上，再通過特異性反應(yīng)使抗原固相化）。經(jīng)純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機(jī)化合物，由于分子量太小，往往難于直接吸附在酶標(biāo)板上，一般都先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如BSA等偶聯(lián)，偶聯(lián)物吸附于固相載體上。
2.包被液的選擇一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液，如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話，也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液。
3.包被溫度的選擇通常是4-8度條件下過夜或者37度保溫2小時(shí)，我們強(qiáng)烈建議4-8度條件下包被，有利于蛋白活性的保持。
4.包被濃度的選擇包被的zui適濃度隨固相載體和包被物的性質(zhì)變化，一般蛋白質(zhì)的包被濃度為1-5ug/ml，要明確針對(duì)特定包被抗原的zui適包被濃度需要通過實(shí)驗(yàn)來確定。包板后需要封閉嗎？應(yīng)該選擇什么樣的封閉體系？封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。而在間接法測(cè)定中，封閉一般是*的。常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉，AbMART使用5%脫脂奶粉，價(jià)廉而且封閉能力強(qiáng)，不過5%脫脂奶粉只適合短期內(nèi)使用，不宜保存，所以ELISA試劑盒中較少使用。